荧光探针是活细胞成像与生物分子动态研究的核心工具。近年来，染料-自标签蛋白（self-labeling protein tags, SLPs）因其高度的通用性和灵活的染料适配性，成为超分辨成像、单分子检测、膜电位记录等先进成像技术中的关键组件。然而，染料在长时间成像中仍面临光漂白这一“老问题”，而此前相关优化几乎均集中于染料本身的化学修饰，而对于蛋白质微环境对染料带来的影响很少受到关注。

2025年7月18日，北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心，膜生物学国家重点实验室陈知行课题组与新葡的京集团8814、北京生物结构前沿研究中心，膜生物学国家重点实验室陈春来课题组，合作在《美国科学院院报》杂志（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）在线发表了题为“通用硫醚编辑策略增强自标记标签上罗丹明的光稳定性”（Thioether editing generally increases the photostability of rhodamine dyes on self-labeling tags）的最新合作研究成果。研究团队先前发现，染料附近的硫醚（thioether）基团是导致染料快速光漂白的“染料杀手”）。而在广泛应用于活细胞荧光成像的染料-自标签蛋白（self-labeling protein tags, SLPs）体系中，硫醚同样也是影响染料光稳定性的关键因素之一。在此工作中，研究团队进一步提出了“硫醚编辑（thioether editing）”策略，结合蛋白质工程与分子设计，对两种自标记标签蛋白HaloTag和TMP-tag进行优化。一方面，通过应用不同的生物偶联化学，构建出新一代无硫醚产物的自标记标签TMP-tag3.1，实现了与HaloTag相当的光稳定性。另一方面，通过将HaloTag中的Met175突变为Leu，成功将一系列罗丹明染料的光稳定性提升多达4倍，这一策略的普适性在单分子荧光、活细胞荧光成像和膜电位记录等多种应用中被验证。另外，染料在硫醚存在时，荧光成像曲线中存在光漂白速率随时间减缓的现象，据此进一步揭示了染料发射荧光过程中导致硫醚氧化的化学机制，从而进一步验证了“硫醚效应”对染料光稳定性的影响。

找出“染料杀手”：硫醚基团是否影响不同自标记标签的光稳定性

研究团队前期的工作发现，邻近硫醚基团的存在会显著降低染料的光稳定性。对于目前广泛应用的三类SLPs而言，SNAP-tag和TMP-tag3在共价结合过程中均会在染料附近生成硫醚基团，而HaloTag的共价反应不产生硫醚。已有研究指出，对于同一罗丹明染料在HaloTag体系中的光稳定性往往优于在SNAP-tag中的表现。研究团队推测，这种差异可能部分源于SNAP-tag和TMP-tag3所固有的硫醚基团带来的负面影响。

为进一步研究硫醚基团对罗丹明染料光稳定性的影响，研究团队通过单分子荧光实验定量比较了同一罗丹明染料分子在三种标签系统中的光稳定性，发现HaloTag系统往往优于SNAP-tag和TMP-tag3，染料发射的总光子数可以有2~3倍的差异（图1）。更进一步的，研究团队利用不同的巯基生物偶联策略和临近位置Met残基突变的方式，验证了硫醚基团在SLPs中对光稳定性的重要影响。

图1.单分子荧光定量表征罗丹明染料在不同自标记标签上的光稳定性

驯服“染料杀手”：利用硫醚编辑策略提升成像质量并利用蛋白质质谱验证硫醚氧化机制

基于这一发现，研究团队进一步提出“硫醚编辑”策略——降低或消除荧光染料附近的“硫醚效应”可以显著提升染料的光稳定性。在验证了HaloTag系统中硫醚对于罗丹明类染料光稳定性的影响后，研究团队筛选出HaloTag: M175L突变体作为对于罗丹明类染料广泛适用的高光稳定性成像平台，并将其应用在了电压成像和结构光照明（SIM）超分辨成像中（图2），显著延长了高质量活细胞荧光成像时间。

图2. HaloTag-M175L在电压和SIM成像中改善罗丹明染料的光稳定性

研究团队在多种细胞成像条件下观察到，M175与M175L之间的光漂白速率差异在初始阶段显著高于后续阶段，这可能源自不同阶段下不同的光化学机理。在前面的工具开发中，M175已经被证明为是HaloTag中可以提升光稳定性的关键位点。为进一步其背后的化学机制，研究团队与Kai Johnsson课题组的Julian Kompa展开合作，利用可交换HaloTag工具，对染料-蛋白复合体的光照过程进行蛋白质质谱监测。发展在染料被激发的条件下，HaloTag中的Met175发生了特征性的氧化。据此，研究团队推测，对于广泛应用于活细胞成像的HaloTag，其M175的存在导致了成像前期光漂白的加速；而后期，由于M175中的硫醚基团被氧化为亚砜或砜，使得硫醚效应不复存在，从而使得光漂白的后期不受到硫醚效应的干扰，进而减缓了光漂白速率（图3）。

图3. 质谱验证M175在染料光漂白过程中的关键化学机制

综上，本研究提出染料微环境中的“硫醚效应”广泛影响了细胞成像中的光稳定性并部分带来了不同SLPs中的光稳定性差异。并且，这一影响往往主要集中于成像的前期，成像的后期由于硫醚光氧化过程而逐渐被抑制。应用“硫醚编辑”策略，研究团队优选了HaloTag：M175L突变体，这一SLP蛋白质标签可显著提升多种罗丹明染料的光稳定性，从而助力活细胞成像和超分辨显微成像，并拓展了荧光分子微环境调控染料性质的研究维度。

北京大学生命科学联合中心2019级博士生凌靖（已毕业，现为美国加州大学圣地亚哥分校博士后）、北京大学未来技术学院2019级博士生张源（已毕业，现为美国加州大学尔湾分校博士后）、新葡的京集团88142017级博士生黑永朕（已毕业）为本文的共同第一作者。北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心陈知行副教授，新葡的京集团8814陈春来副教授和张源博士为本文的共同通讯作者。德国马普所2021级博士生Julian Kompa和Kai Johnsson教授对于机理探索提供了重要证据。新葡的京集团8814已出站博士后杨辰博士进行了重要的前期探索工作。北京大学李毓龙教授、邓伍兰研究员、邹鹏副教授共同参与了该项研究工作。北京大学生命科学联合中心2020级博士生王波、北京大学未来技术学院博士后张钧维、北京大学未来技术学院2024级博士生杜佳晟、德国马普所Tatjana Rudi、北京大学未来技术学院2020级博士生（已毕业）张珂诚、清华大学细胞影像平台主管王文娟工程师、德国马普所Sebastian Fabritz对文章做出了重要贡献。

本工作得到了国家自然科学基金委，科技部国家重点研发计划，膜生物学国家重点实验室，北京市科委，北京市生命科学前沿培育项目，北京分子科学国家研究中心，北京生物结构前沿研究中心和德国研究基金会的经费资助与北京大学分析测试中心，国家蛋白质科学基础设施（北京）北大分中心，清华大学蛋白质研究技术中心细胞影像平台，和广州超视计生物科技有限公司的技术支持。

论文链接：

www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2426354122